細(xì)胞名稱：E14小鼠胚胎干細(xì)胞ATCC

細(xì)胞代次：P4

細(xì)胞規(guī)格：T25瓶（包郵）/2冷凍管（需加干冰運(yùn)輸費(fèi)）

細(xì)胞凍存：無(wú)血清凍存液

細(xì)胞傳代：第一次建議1:2

細(xì)胞收到后處理

培養(yǎng)至良好狀態(tài)后灌滿培養(yǎng)液并封好瓶口是運(yùn)輸細(xì)胞的最好辦法。收到細(xì)胞用75%酒精噴灑整個(gè)細(xì)胞瓶，消毒后放到超凈臺(tái)內(nèi)嚴(yán)格無(wú)菌操作，將細(xì)胞瓶放入37℃、5%CO₂的培養(yǎng)箱中靜置3-4小時(shí)以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)后再做處理。顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照保存（最好40x,100x,200x各一張），前三天照片是重要售后依據(jù)，不提供照片默認(rèn)收到狀態(tài)良好。（注意密封培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱時(shí)要將蓋子擰松，傳代后建議一瓶用原瓶的培養(yǎng)基，另外一瓶用自己配的培養(yǎng)基，以便進(jìn)行對(duì)比培養(yǎng)）

培養(yǎng)前的工作準(zhǔn)備充分

包括耗材的處理、試劑的配置，無(wú)菌檢驗(yàn)等等。

玻璃器皿的清洗。對(duì)于玻璃器皿（細(xì)胞瓶、裝營(yíng)養(yǎng)液的瓶子、小青m素瓶等）要先用洗衣粉刷干凈（注意死角），然后沖干凈。用酸液浸泡 24 h 以上，之后用清水沖洗 10 遍，除去殘留酸液。瓶子之類，沖洗過(guò)程要使勁搖晃。然后在雙蒸水浸泡 24 h。晾干后包扎，160℃ 干烤 2 h 待用。

試劑配置。細(xì)胞培養(yǎng)用的液體一般使用雙蒸以上的水即可。并注意 pH 值的調(diào)節(jié)。

無(wú)菌檢驗(yàn)。主要采用過(guò)濾除菌：如抗生素、G-418 溶液、各類培養(yǎng)基、丙酮酸鈉等。有些可以采用高壓滅菌，如 PBS、D-Hank's等。

試劑分裝保存

包括營(yíng)養(yǎng)液、血清等。

血清特別重要。血清必須貯存于 –20℃，如果一次無(wú)法用完一瓶，可將 40～50ml 分裝于無(wú)菌酸處理瓶中，甚至置青m素瓶保存。一般廠商提供的血清為無(wú)菌，不需再無(wú)菌過(guò)濾。若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物，則可將血清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過(guò)濾，勿直接過(guò)濾血清。（一般情況下不影響細(xì)胞培養(yǎng)）

瓶裝血清一定要逐步解凍: 4℃ 冰箱全溶后再分裝，在溶解過(guò)程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。勿直接由 –20℃ 直接至 37℃ 解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀。

熱滅活是指 56℃，30 分鐘加熱已解凍之血清。水浴鍋升到 56℃后，將血清放入，待溫度升高到 56℃ 后計(jì)時(shí)，一般 5 分鐘左右規(guī)則搖晃均勻一次。此熱處理之目的是使血清中之補(bǔ)體成份去活化。除非必須，一般不要作此熱處理，因?yàn)闀?huì)造成沉淀物之顯著增多，且會(huì)影響血清之品質(zhì)。注意更換新血清（包括不同批次）對(duì)細(xì)胞的影響。

注意事項(xiàng)：有些細(xì)胞比較特殊，如貼壁不牢，在運(yùn)輸過(guò)程中發(fā)生容易細(xì)胞脫落，這是正常現(xiàn)象。請(qǐng)將培養(yǎng)瓶所有培養(yǎng)液收集至離心管，1000rpm離心5min，收集上清作過(guò)渡培養(yǎng)（后期對(duì)比培養(yǎng)），沉淀加入消化液1-2ml，輕輕吹打，重懸，消化1-2分鐘后，加5ml培養(yǎng)基終止反應(yīng)。再離心，棄上清，加1-2ml培養(yǎng)基重懸。然后按1:2比例進(jìn)行分瓶傳代（兩個(gè)T25），補(bǔ)充新的培養(yǎng)基至5-8ml/瓶，最后放入37℃,5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

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